XXV. カイジ清膏による人の直腸癌HR8348細胞アポトーシスに関する実験研究
程若川、湯礼貫、蘭麗琴（昆明医学院第1付属病院、雲南昆明 650031）
「中国腫瘍」２００３年第２期
抄録：[目的] カイジ清膏が体外で人の直腸癌HR8348細胞に対する生長抑制作用とアポトーシス作用及び作用メカニズムを検討する。対数生長期にあるHR8348をカイジ清膏培養基に36時間培養し、MTT 比色法でOD値を測定して、抑制率を計算する；メチルグリーン・ピロニン染色法とTUNEL法で細胞アポトーシス指数を測定する；免疫組織化学方法でBcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak及びp53遺伝子発現情況を研究する。［結果］①カイジ清膏がHR8348細胞に対する抑制率は濃度増加とともに上昇し、濃度が4.0mg/mlの場合に抑制率は最大で71.1%である。5-Fu 10ug/ml対照群に比べて明らかな差が認められなかった(P>0.05) 。二種類のアポトーシス測定方法ではいずれも典型的な細胞アポトーシスアポトーシス小体或は空泡化現象が見られる。アポトーシス指数はカイジ清膏濃度の増加とともに増加し、濃度が4.0mg/mlに達する場合、アポトーシス指数は迅速に上昇し、メチルグリーン・ピロニン法で0.1620、TUNEL法で0.2612に達し、いずれも5-Fu 10ug/ml対照群のアポトーシス指数より多き、明らかな差が認められた(P<0.05)。カイジ清膏群のBcl-2、Bcl-XL、Bak、p53蛋白発現は無処置対照群に比べて明らかに増強し（P <0.05）、Bax変化ははっきりしない（P <0.05）。カイジ清膏群Bak/Bcl-2とBak/Bcl-XLの比値は無処置対照群より明らかに大きい。
結論 ①カイジ清膏は体外で人の直腸癌HR8348細胞に対して明らかな抑制作用とアポトーシス誘発作用を持つ。②カイジ清膏の人の直腸癌HR8348細胞アポトーシス誘発はBak/Bcl-2、Bak/Bcl-XL比値を高め、p53遺伝子発現を高く調節することと関与する可能性がある。
キーワード：細胞アポトーシス；遺伝子、Bcl-2；遺伝子、p53；カイジ清膏；HR8348細胞；直腸腫瘍
中図分類番号：R73-3；R735.3+7文献標識番号：B文章番号：1004-0242（2003）02-0122-03
直腸癌は消化管でよく見られる悪性腫瘍である。現在、直腸癌化学療法は依然として5-Fuを主とし、低毒或は無毒しかも耐薬性の抗ガン新薬を切実に研究開発する必要がある。金克カイジ薬品はここ数年、開発された国家一類抗ガン新薬で、すでに広範に直腸癌を含める各種悪性腫瘍の治療に用い、一定の臨床治療効果が得られた。しかしカイジの抗ガン作用メカニズム、特に細胞アポトーシスに関する研究はとても少ない。カイジが人の直腸癌に対する抗ガン作用とメカニズムを検討するため、私達はカイジが人の直腸癌HR8348細胞に対する生長抑制作用、アポトーシス誘発作用及びアポトーシス調節遺伝子Bcl－2、Bcl－XL、Bax、Bakとp53発現の影響を研究し、国家の漢方薬第一類新薬－金克カイジ薬品が直腸癌の治療に使われる理論根拠を提供したい。
１材料と方法
１. １実験細胞
HR8348細胞は直腸の低分化腺癌で、浙江省腫瘍研究所から提供する。培養液は20％小牛血清を加えたPRMI1640で、1ミリリットルにペニシリンが100 u、ストレプトマイシンが100μｇ、ヒドロコルチゾンが10μｇ、インシュリンが0.01uを加え、37℃，5％ＣＯ2。
１. 2薬品調合
乾燥したカイジ清膏を10.0g精密に量り、それを100mlの単PRMI1640培養液に溶かし、0.20μｍの濾過滅菌器（CORNING会社の製品）で濾過滅菌し、100mg／mlのカイジ清膏含有培養液とする。使用前、培養液でそれぞれ0.5mg／ml～6.0mg／mlの工作液に希釈する。
１. 3体外での薬物の腫瘍抑制実験
テトラゾリウム塩（MTT）の比色法を用いる。MTTはSino－American Biotechnology会社の製品である。対数生長期のHR8348細胞を取り、細胞濃度を5×104／mlまで調節し、96ウエルプレートに接種し、各穴に0.1mlを加える。細胞を5％CO2、37℃のインキュベータに置き、24時間培養する。古い培養液を廃棄し、各穴に濃度がそれぞれ0.5mg／ml、1.0mg／ml、2.0mg／ml、4.0mg／ml、6.0はmg／mlのカイジ清膏含有培養液を0.2ml加え、別に無処置対照群と5－Fu 10μｇ／ml群を設け、各群に12穴を設ける。続いて5％CO2、37℃のインキュベータに置き、36時間培養する。各穴に0.5％MTT 20ilを加え、続いて4時間培養する。培養液を吸出し、各穴にジメチルスルホキシド（DMSO）100μｌを加える。Wellscan Mk3ＥＬＩＳＡ測定装置（Labsystems会社の製品）に置き、15秒間振動してから、波長570nmで吸光度OD値を測定する。結果は下記の式によって抑制率を計算する：
抑制率＝1－実験穴OD値／対照穴OD値×100％
１. 4アポトーシス細胞の形態学検査 メチルグリーン・ピロニン染色法を採用する。メチルグリーンとピロニンはそれぞれFluka会社とChroma会社の製品である。対数生長期のHR8348細胞を取り、細胞濃度を5×104／mlまで調節し、カバーガラス付きの24ウエルプレートに接種し、各穴に1mlを加える。細胞を5％CO2、37℃のインキュベータに置き、24時間培養する。古い培養液を廃棄し、各穴に濃度がそれぞれ0.5mg／ml、1.0mg／ml、2.0mg／ml、3.0mg／ml、4.0mg／mlの槐耳清膏含有培養液2mlを加え、別に無処置対照群と5－Fu 10μｇ／ml群を設け、計7群、各群に4穴を設ける。続いて5％CO2、37℃のインキュベータに置き、36時間培養する。細胞付きカバーグラスを取り出し、メチルグリーン・ピロニン染色、染色方法は文献によって行う。結果として各細胞付きカバーグラスを光学顕微鏡で無作為に10個の高倍視野を観察し、その中にアポトーシス細胞が細胞総計に占める割合を量り、細胞アポトーシス指数（AI）とする。
１. 5アポトーシス細胞の生化学検査 TdT誘発のDutp末端に目印をつける方法 （TUNEL法）を採用する。アポトーシス検査試薬セットは福州邁新生物技術開発会社から購入した。細胞接種、薬投与、分組及び結果観察はメチルグリーン・ピロニン染色法と同じ、各群に4穴を設ける。染色手順は厳格に説明書に準じて行う。Dnase Iを加え、陽性対照とし、TdTを加えない反応液を陰性対照とする。
１. 6アポトーシス調節蛋白Bcl－2、Bcl－XL、Bax、Bak及びp53の測定 細胞免疫組織化学方法を採用する。Bcl－2、Bcl－はXL、Bax、Bak、p53モノクロ抗体とSP試薬セットは北京中山生物技術有限会社から購入した。細胞接種と薬投与はメチルグリーン・ピロニン染色法と同じである。カイジ清膏4.0mg／mlと無処置対照群を両群に分け、各群は4穴を設ける。染色手順は厳格に説明書に準じて行い、第一抗体の代わりにPBSを陰性対照とする。結果観察として細胞付けカバーグラスを光学顕微鏡で無作為に10個高倍視野を検査し、陽性細胞のカウント値と染色強度値の積によって採点する［2］。その中、陽性細胞カウント値：0，≦5％；１，5％～25％；2，25％～50；3，50％～75％；4，≧75％。染色強度採点：１，弱陽性；2，中度陽性；3，強陽性。
１. 7データ統計分析
SPSS10.0forwindows統計パッケージソフトで単変量の分散分析を行う。P<0.05を統計学的に有意差のある結果とする。
2 結果
2. １カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞生長に対する影響
カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞に対する抑制率は濃度増加とともに上昇し、一定の用量依存性を呈する。その中に4.0mg／mlと6.0mg／mlの両濃度群の抑制率はそれぞれ71.1％と68.4％を達したが、対照群5－Fu 10μｇ／ml（体内血液ピーク濃度）の抑制率は66.5％で、三者の間に明らかな有意差が認められなかった（Ｐ>0.05）。
2.2カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞に対するアポトーシス誘発作用
2.１.１メチルグリーン・ピロニン染色法
メチルグリーン・ピロニン染色後、アポトーシスのHR8348細胞は光学顕微鏡で細胞核濃縮して青緑色に、細胞質は赤紫色に濃く染められ、アポトーシス小体も見られる。アポトーシス指数はカイジ清膏濃度の増加とともに増加し、濃度が4.0mg/mlに達する場合、アポトーシス指数は迅速に上昇し、メチルグリーン・ピロニン法で0.1620、TUNEL法で0.2612に達し、いずれも5-Fu 10ug/ml対照群のアポトーシス指数より多き、明らかな差が認められた(P<0.05、表１省略)。
2.2.2 TUNEL染色
TUNEL染色した後、アポトーシスのHR8348細胞は光学顕微鏡で細胞体積が縮小、細胞核が青黒色に染れ、発泡現象を呈する；部分の核が青黒色或は薄青黒色に染める細胞と正常細胞は形態学に差異がない。Dnase I作用の陽性対照は陽性とし、TdTの陰性対照は陰性とする。TUNEL法で測定したアポトーシス指数の変化情況はメチルグリーン・ピロニン法と基本的に一致し、他但し、TUNEL法のアポトーシス指数はメチルグリーン・ピロニン法（表1をご参考）より大きい。その中にカイジ清膏濃度4.0mg／mlのアポトーシス指数は（0.2612±0.0158）で、5－Fu 10μg /ml対照群に比べて明らかな有意差が認められた（P<0.05〉。
2.3カイジ清膏がアポトーシス調節遺伝子発現に対する影響
2.3.１ Bcl－2家族遺伝子発現に対する影響
Bcl－2、Bcl－はXL、Bax及びBakの発現は主に細胞質に位置し、陽性細胞質は茶黄色を染められる。無処置対照群に比べて、カイジ清膏群Bcl－2、Bcl－XLとBakの発現は明らかに増強したが、Baxの変化ははっきりしない。一次抗体に代わるPBS陰性対照群は陰性である。
Bcl－2家族蛋白発現の免疫組織化学染色の採点について表2をご参考する。カイジ清膏群のBcl－2、Bcl－XLとBak発現採点は無処置対照群より大きく、特にBakは明らかな差（Ｐ<0.05）を認められたが、Baxと無処置対照群は明らかな差が認められなかった（Ｐ＝0.585）。
カイジ清膏Bak／Bcl－2、Bak／Bcl－XLの比値は無処置対照群（表3をご参考）より明らかに大きい。
2.3.2 p53遺伝子発現に対する影響
p53蛋白発現は細胞核で位置し、茶黄色に染められる。カイジ清膏群の細胞は顕微鏡でp53高発現が見られたが、無処置対照群は基本的に陰性を示す。カイジ清膏群p53免疫組織化学染色の採点は無処置対照群より明らかに高い（P<0.001、表2をご参考）。
3 考察
カイジは中国の古槐樹に生長する1種類薬用真菌??かい栓菌（Trametes robiniophila Murr）で、”治風”、”破血”、”益力”の効果を持ち、民間では癌と炎症の治療に用いる。カイジ菌質を熱水で抽出したカイジ清膏は多種類の有機成分と10数種類の鉱物質元素を含み、主要な抗ガン活性成分は蛋白多糖類（PS－T）である。担腫瘍動物体内での腫瘍抑制試験は、カイジ清膏が明らかな腫瘍成長抑制と担腫瘍動物の生命延長作用を持ち、しかも動物毒性試験では毒副作用が認められない。現在、その完成品とする――金克カイジ薬品（国家第一類新薬）は臨床に使われている。報告によると［4～8］、カイジ散剤は中期、末期肝臓癌に独特な治療効果を持ち、明らかな毒副作用がない；カイジ散剤併用その他の化学療法は大腸腫瘍、非小細胞肺がん 、末期胃癌、再発性非ホジキンリンパ腫などの治療に用い、一定の治療効果がある。その抗腫瘍メカニズムについての研究：カイジは体の免疫機能の調節と促進機能を持ち、それによって腫瘍細胞の殺傷と抑制作用を果たす［3］。（2）いくつかの腫瘍細胞はアポトーシス誘発を通して直接的に細胞毒性作用を発揮することができる［9］。しかし槐耳抗ガン作用に関する基礎研究はとても少なく、特に抗大腸腫瘍の面ではまだ空白である。
3.１カイジが人の直腸癌HR8348細胞に対する生長抑制作用
本実験では、カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞に対して明らかな抑制作用を持ち、カイジ清膏が一定の薬物濃度を達する場合、抑制率は最大値に達し、更に薬物濃度を高めると逆に抑制率は少し下がったが、統計学的に意義差がなく、カイジ清膏がHR8348細胞に対する抑制作用は一定の用量依存性が認められた。
3.2カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞に対するアポトーシス作用
細胞アポトーシスは近代生物医学領域で研究焦点の一つで、胚胎発育、器官の成熟課程に極めて重要な作用を発揮するだけではなく、腫瘍など疾病の発生、発展と治療と密接に関連する。本実験の二種類のアポトーシス方法は典型的なアポトーシス細胞、アポトーシス小体と発泡現象が認められた。HR8348細胞アポトーシス指数はカイジ清膏濃度の増加とともに増加し、カイジ清膏は一定の濃度を達する場合、アポトーシス指数は迅速に上昇し、カイジ清膏は一定の薬物濃度で明らかな人の直腸癌HR8348細胞アポトーシスを誘発することが説明された。本研究ではTUNEL法のアポトーシス指数がメチルグリーン・ピロニン染色法より大きく、TUNEL法で測定された一部分アポトーシス細胞がアポトーシス初期にあるので、まだ典型的なアポトーシス細胞の形態学特徴が現れていないからである。
3.3カイジ清膏がBcl－2家族遺伝子発現に対する影響
細胞アポトーシスは細胞内一連の遺伝子、例えば（Bcl－2、p53、C・mycなど）ネットワーク式の精密なコントロールを受け、その中にBcl－2家族遺伝子は細胞アポトーシスの主な調節遺伝子である。Bcl－2家族遺伝子は機能によって2種類に分け、1種類は細胞アポトーシス遺伝子を抑制する遺伝子：例えばBcl－2、Bcl－XLなど、もう1種類は細胞アポトーシスを促進する遺伝子：例えばBax、Bakなどである。Bcl－2家族遺伝子発現の蛋白は各自の同源区域の相互作用を通して、同じ或は異なる二量体を形成して細胞アポトーシスを加減することができる。報道によると［10］、Bcl－2はBcl－XLとBax或はBaKと結合すると、後の両者のアポトーシス促進作用を抑制できる。本研究では、カイジ清膏群比値が無処置対照群より明らかに大きかったが、Bak／Bcl－2、Bax／Bcl－XLの比値と両者の差は大きくない。これで、カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞アポトーシスを誘発することはBak／Bcl－2、Bax／Bcl－XLの比値を高めることと関係があると推測されている。
3.4カイジ清膏が遺伝子発現に対する影響
p53も細胞アポトーシスと密接に関連する遺伝子で、野生型と突然変異型に分ける。野生型p53は正常細胞によく見られ、細胞アポトーシスに対して促進作用を果たし；突然変異型p53は腫瘍によく見られ、細胞アポトーシスに対して抑制作用を果たす。しかしもいくつかの突然変異型p53は細胞成長を抑制し、細胞アポトーシスを促進することができると報告された［１１，１2］。野生型p53蛋白は細胞中での半減期がとても短く、突然変異型p53蛋白の半減期が比較的に長く［13］、ですから、免疫組織化学方法で検出されたのは主に突然変異型p53蛋白である。本研究では、カイジ清膏群のp53蛋白発現は弱まるではなく、かえって明らかに増強された。同じ濃度のカイジ清膏はこの時にHR8348細胞アポトーシスが明らかに誘発された。これで、カイジ清膏がHR8348細胞アポトーシスを誘発するのはp53遺伝子発現を高く調節することと関与する可能性が推測された。
3.5 本研究の不足
カイジ清膏が4.0mg／mlと6.0mg／mlの場合、人の直腸癌HR8348細胞に対する抑制率は5－Fu 10μｇ／mlと明らかな差がなく、ひいてはカイジ清膏4.0mg／ml群のアポトーシス指数は5－Fu 10μｇ／ml群より大きいが、本研究でカイジ清膏と5－FuがHR8348細胞に対する最大抑制率及び最大アポトーシス作用を測定していないので、カイジ清膏が人の直腸癌HR8348細胞の抗ガン作用と5－Fu効果の比較について、更に研究する必要がある。
参考文献：
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［9］黄涛、孔慶志、盧宏達ら カイジ清膏が人の肺腺癌細胞A549アポトーシスを誘発する実験［J］ 中華結核と呼吸雑誌、200１，24（8）：503。